一、目的
    (Fab')2-ELISA是酶联免疫吸附测定中zui灵敏的检测方法之一，配合背景反应很浅的碱性磷酸酯酶检测下限可以达到纳克水平，对于少量样品或含量低的病毒检测效果好。它利用蛋白酶去掉抗体IgG中的Fc片段，使双抗体夹心的优点只使用一种抗体就可以实现。
二、实验材料和用具
    1.专化性抗体免疫球蛋白IgG(浓度约为1mg/ml)。
    2.系统感染病毒的植株和健康植株。
    3.酶标记羊抗兔抗体球蛋白IgG(市售)或A蛋白标记的碱性磷酸酯酶(Sigma产品)。
    4.酶联板、微量加样器、洗瓶、酶联读数仪。
    5.抗原包被缓冲液、洗涤缓冲液、IgG稀释缓冲液、底物溶液。
三、实验步骤
    1.配制缓冲液 
      ① 抗原包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6) 
         Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g蒸馏水加至1升。
      ② 洗涤缓冲液(0.02MPBS-吐温缓冲液，PBS-T，pH7.4) 
         NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.9g；KH2PO4 0.2g； 
         KCl0.2g；NaN30.2g；蒸馏水加至1升后加Tween-200.5ml.
      ③ IgG稀释缓冲液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液) 
         取0.1g牛血清白蛋白溶于用灭菌蒸馏水配制的PBS-T缓冲液100ml中即成。 
      ④ 底物溶液(邻苯二胺溶液) 
         a液：柠檬酸19.2克加水溶至1000ml为0.1M柠檬酸溶液 
         b液：Na2HPO4.12H2O71.6g加水溶至1000ml为0.2MNa2HPO4溶液。 
         取a液24.3ml加b液25.7ml混合即成磷酸盐-柠檬酸缓冲液pH5.0 。 
         称取40mg邻苯二胺，溶解后过滤，加上述缓冲液至100ml，临用前加30%H2O2 0.15ml即成。
      ⑤ 碱性磷酸脂酶底物缓冲液： 
         二乙醇胺缓冲液：二乙醇胺97ml，蒸馏水800ml，混合，用浓HCl调pH=9.8，加水至1000ml。取硝基酚磷酸pNPP60mg溶于100ml上述二乙醇胺缓冲液中，即为底物缓冲液(现配现用，时间长了会变色)。 
         碱性磷酸脂酶标记的A蛋白，溶于1.0ml50%甘油中即可使用。 
    2.取显症叶片和健康叶片用抗原包被缓冲液分别配制1:10，1:100，1:1000样品悬浮液，过滤或低速离心后备用。 
    3.按设计(同实验三)在酶联板上加样，每孔200μl，(Fab')2以1/2000-4000的比例稀释在50mM包被缓冲液(pH9.6)中；在30℃下孵育四小时，或4℃放置一个晚上(时间长，包被好)； 
    4.洗板三次同实验三； 
    5.样品稀释在提取缓冲液中，4℃下孵育放置一个晚上；洗板同前； 
    6.IgG(可用未纯化的抗血清)以1/2000-4000的比例稀释在提取缓冲液中，30℃孵育三小时，洗板同前； 
    7.酶标A蛋白以1/2500比例稀释在提取缓冲液中，30℃孵育三小时，洗板同前； 
    8.加底物，室温孵育不超过30分钟(过氧化物酶)，2-4小时(碱性磷酸酯酶)，用酶联免疫检测仪测定结果。
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