酶联免疫斑点法是ELISA方法中的一种，目前国内很少客户用这种方法检测，一般都是用的双抗体夹心法及间接法，酶联免疫斑点法国内很少客户用这种方法检测，但是我们也该清楚他们的操作步骤，下面让我们一起来看看我司钱为客户准备的酶联免疫斑点法操作步骤：

1.用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。
2.倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。
3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul，盖上板盖。
4. 倒去液体，100ul PBS洗涤一次。
5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS(见试剂准备)，盖上板盖，室温下孵育2小时。
6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
7.用100ul PBS洗涤一次。
8.每孔加入100ul细胞悬浮液(含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂)。细胞可预先在体外接受刺激(间接Eli-spot)。盖上标准的 96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间(15-20小时)。这期间不要晃动或移动孔板。
9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。
11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，37℃下孵育1小时30 分。
13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，37℃孵育1小时。
15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室温下反应5-15分钟。*显色后，将此液倒于相应的盘中。
18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一 夜，点会比较明显。此板在室温下避光保存。