考马氏亮蓝G－250染色法使用方法

【操作步骤】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。

在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。
2、血清蛋白质测定
稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作。混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。

【原 理】
考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，zui大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。
【注意事项】
1、常用试剂的干扰：有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较少影响，而1％SDS、1％ TritonX-100及1％Hemosol的干扰严重。
2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。
3、考马氏亮蓝G－250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在0.1mol/L HCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。

【试 剂】
1、考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀释到1升。
2、蛋白标准（0.1mg/ml）
准确称取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，－20℃冰箱保存。
【计 算】
每100毫升血清中蛋白质的含量（g％）

此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。