单克隆抗体的克隆化方法

    经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

    克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。

克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。

   （一）有限稀释法

    1．材料

   （1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。

   （2）HT培养基

    2．操作方法

   （1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

   （2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

   （3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

   （4）5％CO₂饱和湿度，37℃培养。

   （5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

   （6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

   （7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

   （二）软琼脂克隆化

    借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：

    1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

    2．将117ml*DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。

    3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的*DMEM液，并加75×10⁸ 脾细胞。

    4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。

    5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。

    6．放入CO₂箱饱和湿度，37℃培养10天。

    7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。

    8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO₂箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。

    （三）显微镜操作法

    在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×10⁸细胞悬液放置5％CO₂饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×10⁴~5.0×10⁴饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。

   （四）荧光激活分离法

用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。