干扰素的实验步骤及其注意事项

日期：2013-03-27浏览：3226次

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

实验步骤

1. 制备诱生剂：采用NDVF系弱毒株，以鸡胚尿囊液形式保存于-20℃，

其血凝滴度稳定在1:640～1:1 280之间。大量繁殖时，用0.5%水解乳蛋白稀释100～1 000倍，接种于9日龄鸡胚尿囊腔，置37℃培养72h后，收获尿囊液，效价测定应大于1:640，无菌检查应合格。

2. 制备诱生细胞：无菌采取人外周血（多用人脐带血，或血库贮藏血），置于含肝素的无菌瓶内，于4℃保存不超过24h，诱生细胞（白细胞）不单独提取，以全血代替。

3. 制备粗制干扰素：

1）加诱生剂，按1ml抗凝全血加0.2ml诱生剂（即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1:640）；

2）加温吸附，将加有诱生剂的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃动一次，使NDVF吸附于白细胞上。然后以1000r/min离心20min，弃上清，留沉淀物；

3）加营养液孵育诱生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle营养液于上述沉淀物中，混匀，置35～36℃温箱内旋转培养18～20h；

4）离心及酸处理，将上述培养物以2000r/min离心30min，取上清，以6mol/L盐酸将其pH值调至2.0，置4℃冰箱5天灭活NDV；

5）中性化，经5天酸化后，再用6mol/L氢氧化钠将pH值调至7.2～7.4，即为粗制干扰素。

4. 制备精品干扰素：

1） KCNS沉淀，取上述粗制干扰素，加KCNS并用2mol/L HCl调pH值为3.5，然后以2 000r/min离心30min取沉淀；

2）酒精提取，将沉淀溶于95%酒精（预冷至-20℃），用2mol/L NaOH调pH值为4.2，以2 000r/min离心30min取上清；用2mol/L HCl调pH值至3.5，离心后取上清，再将pH值调至5.6，离心后取上清，zui后将pH值调至7.1，离心后取沉淀；

3）过碘酸钠沉淀，将沉淀溶于PBS中，加过碘酸钠，并调pH值为4.5，用50%乙醇10倍稀释，离心后取上清，将上清液对0.3mol/L （NH4 ）2 CO3 （pH值7.6）在4℃下透析过夜。

4） sephacryl S200柱层析：将sephacryl S200按要求处理后装柱（4～5×100cm柱），用PBS平衡后，加样（即上述上清液），用洗液洗脱。洗脱期间用核酸蛋白仪连续检测，收集相应峰即为精制干扰素。取样进行效价测定，按结果进行稀释，分装并冻干。

5. 检定

1）效价测定

a. 制备攻击病毒：将水泡性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维母细胞上传代后，

再在猪细胞（IBRS）上传3～5代，使其对IBRS有良好致病效应，其TCID50应稳定（一般在10-6 ～10-7 之间）。

b. 准备测定细胞：生长良好的幼龄IBRS单层细胞。

c. 测定：取上述单层细胞分为若干组，每组加不同稀释度的干扰素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100个TCID50的VSV攻击，置37℃ 48～72h孵育后，观察结果。同时设细胞对照组和病毒对照组。病毒对照组CPE＞75%，正常细胞对照组CPE=0，即认为该测定系统有效。干扰素判定标准是以能保护半数细胞免受攻击病毒损害的干扰素zui高稀释度的倒数作为干扰素的单位。

2）酸碱度测定

取本品10支，加水溶解，精密测量pH值应为6.0～7.5。

3）水分测定

按磺硫溶液法测定，不得超过3%。

4）安全试验

取本品加水溶解，小鼠尾静脉注射，48h内不得有死亡。

5）热原检查

取本品1支，加水溶解，依法检查，应符合规定。

6）菌检

取本品3支，无菌水溶解，分别接种到检查需氧菌、厌氧菌及霉菌用培养基上，37℃培养1周，应无菌生长。

7）超敏反应

取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品适量，连续3次，于20天后再于耳静泳注入本品适量，应无过敏反应现象发生。