一、关于夹心ELISA

夹心ELISA测定两层抗体（即捕获抗体和检测抗体）间的抗原。靶抗原必须包含至少两个能够结合到抗体的抗原位点。单克隆或多克隆抗体均可在夹心ELISA系统中用作捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体识别单一表位，可对抗原中微小差别进行定量。多克隆抗体通常用作捕获抗体以沉降尽可能多的抗原。

夹心ELISA去掉了分析前的样品纯化步骤，提高了灵敏度（比直接或间接法灵敏2–5倍）。

二、实验步骤

1.用捕获抗体包被

①以捕获抗体浓度为1-10μg/mL的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6)包被PVC微量滴定板的孔。
②未纯化抗体（例如腹水液或抗血清）可能需要增加样品蛋白质的浓度（尝试用10μg/mL）补偿浓度更低的特异性抗体。
③用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜。
④弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。?

2.封闭和加样
①每孔添加 200μL 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/PBS）封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
②用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少1-2小时，或在4℃下孵育过夜。
③用200 μL PBS洗涤微量滴定板两次。
④将100 μL 稀释样品添加到每个孔。通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样品。37°C条件下孵育90分钟。确保标准品浓度涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能需要优化浓度范围以获得合适的标准曲线。通常样品和标准品采取两重测定或三重测定。
??⑤移除样品，用200μL PBS洗涤微量滴定板两次。

3.用检测抗体和二抗孵育

①将100μL稀释的检测抗体添加到每个孔。?确保检测抗体识别与捕获抗体靶蛋白的不同表位。这可防止对抗体结合的干扰。尽可能使用已测试的成对匹配抗体。
②用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育2小时。
③用PBS洗涤微量滴定板四次。
④添加100μL偶联二抗，使用前将其在封闭缓冲液中稀释。
⑤用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育1-2小时。
⑥用PBS洗涤微量滴定板四次。

三、检测

考虑到某些生物材料具有高水平内源酶活性（例如肺泡细胞中的高水平ALP、红细胞中的高水平过氧化物酶），这可能会导致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑（针对ALP）或用0.3% H2O2的甲醇溶液（针对过氧化物酶）进行另外的阻断处理。

ALP底物

对硝基苯磷酸盐(pNPP)是大多数应用常用的底物。室温孵育15–30分钟后在405 nm处测定硝基苯酚呈现的黄色，并加入等量0.75M NaOH 终止反应。

HRP显色液

HRP的底物为过氧化氢。过氧化氢的裂解与氢供体的氧化偶联，反应期间氢供体的氧化使颜色发生变化。

TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）

将TMB溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液(2M H2SO4)，然后在450nm 处读取光密度。

某些酶底物被认为是有害的（潜在致癌物），因此应始终小心处理并佩戴手套。

四、数据分析

由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在X轴（对数标度）上，而吸光度标在Y轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。