干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性 

张宝芹(北京大学滨海医院、天津市第五中心医院消化科，天津市 300450)

引用本文：张宝芹. 干细胞表面标志 CD133 在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性[J].中国组织工程研究，2017，21(9):1319-1323. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.002 ORCID: 0000-0002-5015-9381(张宝芹) 

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文题释义：
CD133：是一种重要的表面标志物，具有*的信号传递通路，可参与到淋巴细胞再循环过程中，与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系。以 CD133 为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同肿瘤干细胞进行分选和研究。此次实验中，即以 CD133 为标志物对人肝癌 MHCC97-H 细胞株进行培养和分选，获得 CD133+/CD133-MHCC97-H 细胞。
Notch 信号途径：是一种细胞间相互作用的基本途径，调控着细胞增殖、分化、凋亡等过程。在 Notch 途径被激活时，干细胞发生增殖，活性受到抑制时，干细胞开始发生分化。
摘要
背景：以 CD133 为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同的肿瘤干细胞进行分选和研究。
目的：探讨干细胞表面标志 CD133 在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外增殖特性。
方法：对人肝癌 MHCC97-H 细胞株进行培养和分选，分别获得 CD133+与 CD133-
MHCC97-H 细胞，检测CD133 表达及细胞迁移侵袭能力；培养 14 d，检测细胞克隆形成率；培养 7 d，检测细胞增殖及 Notch 基因蛋白表达。将 CD133+与 CD133-MHCC97-H 细胞分别接种于裸鼠背部皮下，4 周后，检测成瘤情况。
结果与结论：①CD133 表达与细胞克隆形成率：CD133+MHCC97-H 细胞 CD133 表达率、克隆形成率均显著大于 CD133-MHCC97-H 细胞(P < 0.05)；②细胞增殖：CD133+MHCC97-H 细胞培养 3-7 d 的吸光度值大于 CD133-MHCC97-H 细胞(P < 0.05)；③细胞迁移侵袭：CD133+MHCC97-H 细胞迁移与侵袭实验的透膜细胞数均显著多于 CD133-MHCC97-H 细胞(P < 0.05)；④Notch 基因蛋白：CD133+MHCC97-H 细胞 Notch 基因蛋白表达多于 CD133-MHCC97-H 细胞(P < 0.05)；⑤成瘤实验：CD133-MHCC97-H 细胞组成瘤体积大于CD133-MHCC97-H 细胞组(P < 0.05)；⑥结果表明：CD133 阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性，具有一定的肿瘤干细胞特性，并有较强的侵袭、转移及致瘤能力。
关键词：
干细胞；肿瘤干细胞；肝癌；干细胞表面标志；细胞亚群；细胞增殖；侵袭；转移；干细胞特性；移植瘤；国家自然科学基金
主题词：干细胞；肿瘤干细胞；细胞增殖；组织工程
基金资助：国家青年科学基金项目(81770221)：膜联蛋白 A2 亚硝基化诱导肝细胞癌上皮-间质转化的机制

0 引言 Introduction
肿瘤细胞中存在一定的肿瘤干细胞，这是一类特殊的细胞，具有很强的自我更新及分化能力。临床治疗中，肿瘤干细胞的敏感性不强，容易导致复发等情况的出现，影响预后效果[1]。为此，对肿瘤干细胞相关生物学特性进行分析，寻找有效的治疗靶点至关重要。肝癌是一种常见的恶性肿瘤，肝癌细胞中也存在一定的肿瘤干细胞[2]。在对肿瘤干细胞进行研究时，人类白细胞分化抗原133(CD133)是一种重要的表面标志物[3]。CD133具有*的信号传递通路，可参与到淋巴细胞再循环过程中，与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系[4]。以CD133为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同肿瘤干细胞进行分选和研究。此次实验中，即以CD133为标志物对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选，获得CD133+/CD133-MHCC97-H细胞，并观察其迁移侵袭、成瘤能力以及Notch基因蛋白的表达情况
等，以探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外特性。
1 材料和方法 Materials and methods 
1.1 设计 体外细胞观察性实验及随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年8至12月在北京大学滨海医院实验室完成。
1.3 材料 人肝癌细胞株MHCC97-H由上海信裕生物技术有限公司提供；11周龄雄性BALB/c裸鼠10只，体质量20-25 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SYXK(京)2013-0058。
主要试剂和仪器：DMEM培养基、兔抗人Notch单克隆抗体(北京博尔迈生物技术有限公司)；胎牛血清(北京智杰方远科技有限公司)；CD133抗体(澳大利亚，Hyclone公司)；胰蛋白酶(上海素尔生物科技有限公司)；FCR封阻试剂(北京方程生物科技有限公司)；CD133免疫微珠(北京德诺生物科技有限公司)；Giemsa染色液(北京普博斯生物科技有限公司)；MTT(中国·银河集团-WWW.9873.cσm|官方网站)；细胞裂解液(上海普飞生物技术有限公司)；PVDF膜上(上海睿安生物科技有限公司)；Transwell 小室(上海博耀生物科技有限公司)；光学显微镜(上海市恒斐生物科技有限公司)；流式细胞仪(上海雷浩信息科技有限公司)；酶标仪(北京东胜创新生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 肝癌细胞的培养 利用含胎牛血清的DMEM培养基对人肝癌MHCC97-H细胞株进行常规培养。观察细胞生长情况，待细胞大部分长满后进行传代培养。去掉培养液，PBS洗涤后添加胰蛋白酶进行消化。收集脱落细胞，添加*培养基，置于培养瓶中进行培养。收集对数期细胞，进行后续实验。
1.4.2 肝癌细胞中的CD133表达率 对MHCC97-H细胞进行重悬，调整细胞浓度为1×109 L-1
后，添加CD133抗体进行孵育。30 min后离心，再次重悬，上流式细胞仪进行检测，记录细胞CD133表达率。
1.4.3 CD133+/CD133-MHCC97-H细胞分选[5-6] 添加胰蛋白酶对MHCC97-H细胞进行消化，进行细胞重悬，离心后去掉上清，再次进行细胞重悬。添加FCR封阻试剂和CD133免疫微珠，孵育后进行离心和细胞重悬，过柱后分别收集CD133+、CD133-细胞。进行细胞计数和传代培养，上流式细胞仪进行检测，对分选后细胞的CD133表达率进行检测和记录。

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