高舒妤，朱国宴，郭国宁*

[摘 要] 目的 检测外周血中可溶性B7-H3 在脑创伤合并骨折，单纯骨折和单纯脑损伤患者中的表达，并研究其对间充质干细胞分化为成骨细胞的作用。方法  ELISA检测可溶性B7-H3 及骨折愈合的标志物Cbfa1 在脑创伤合并骨折、单纯骨折，单纯脑创伤和正常志愿者外周血中的表达，茜素红、real-time   PCR 检测不同浓度重组B7-H3 蛋白对间充质干细胞向成骨细胞分化的作用。结果 可溶性B7-H3 在脑创伤合并骨折及单纯脑创伤患者中的表达明显高于单纯骨折和正常人中的表达；可溶性B7-H3 在外周血中的含量与脑创伤严重程度相关；重组B7-H3 蛋白可促进间充质干细胞向成骨细胞的分化，并随着质量浓度的升高其促分化能力增强。结论 脑创伤导致的外周血中升高的可溶性B7-H3 促进了骨折愈合。

[关键词] B7-H3；脑创伤合并骨折；骨折愈合；间充质干细胞

[中图分类号] R392.7 [文献标识码] A

骨折愈合是一个受到全身或局部多因素调控的、包括成骨细胞和破骨细胞参与的动态平衡过程[1]，其愈合速度受多种因素的影响。临床发现颅脑损伤骨折愈合是一个受到全身或局部多因素调控的、包括成骨细胞和破骨细胞参与的动态平衡过程[1]，其愈合速度受多种因素的影响。临床发现颅脑损伤发展相关。对于其非免疫功能，B7-H3 敲除鼠易发生骨折，而且 B7-H3 缺失的颅骨细胞成骨分化受阻，表明B7-H3 参与了成骨细胞的分化过程，采用特异性抗体4H7 刺激人间充质干细胞膜上的B7-H3， 可直接促进其分化为成骨细胞[5-6]。

可溶性B7-H3（soluble B7-H3，sB7-H3）是膜结合型的可溶形式，可由单核细胞，树突状细胞，激活的T 细胞以及mB7-H3+的细胞释放[7]，研究发现在脓毒症患者或儿童肺炎患者中，血清中的sB7-H3 均表达升高，并与炎性因子的释放呈正相关[8-9]。sB7-H3 与骨折愈合的研究未见报道。

间充质干细胞属于成体干细胞，在不同诱导条件下，具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞分化的潜能，并且由于具来源广泛、细胞增殖快、异体移植排斥反应轻等优点，在骨组织工程中备受重视，是形成成骨细胞的主要来源。

为研究sB7-H3 在脑创伤合并骨折愈合中的作用，我们对临床脑创伤合并骨折与单纯骨折患者及单纯脑创伤患者sB7-H3 表达与骨折愈合的关系进行了探讨，研究了体外加入重组B7-H3 蛋白对间充质干细胞分化为成骨细胞的作用。

1资料与方法

1.1临床资料 选取自 2014 年 2 月至 2016 年 11 月入住重庆西南医院急救部的患者共56 例（男36 例， 女20 例），分别纳入单独脑创伤组（TBI）13 例，单独骨折组（Fracture）20 例，脑创伤合并骨折组（TBI +fracture）23 例，骨折部位包括：股骨（femur）骨折14 例， 胫腓骨（tibia and fibula）骨折 11 例，肱骨（humerus） 骨折 10 例，尺挠骨（ulna and radius）骨折 8 例，另选择健康体检志愿者10 例为对照组。入院时有脑创伤的患者按GCS 评分分级：GCS>12 为轻度（Mild）脑创伤（6 例），9≤GCS≤12 为中度（Moderate）（9 例），3≤GCS≤8 为重度（Severe）（8 例），所有病例均排除伤前神经病理或与骨相关的疾病，类风湿性关节炎、糖尿病及采用类固醇或双膦酸治疗的疾病。本研究经lu军军医大学（第三军医大学）附属医院伦理委员会批准并获得患者知情同意书。

1.2血清样本的收集 所有患者均于入院后12 h 内采血，正常志愿者清晨空腹采集外周静脉血 3 ml，4 ℃冰箱放置过夜，3 500 g 离心10 min，吸出上层血清置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3ELISA 检测 人 B7-H3 ELISA 试剂盒购自Ebioscience 公司，人Cbfa1 ELISA 试剂盒购自中国·银河集团-WWW.9873.cσm|官方网站。实验操作按说明书进行。

1.4间充质干细胞培养及诱导分化 培养人间充质干细胞至第3 代，更换间充质干细胞培养基为成骨细胞诱导培养基（赛业生物），并分别加入2 μg/ml 和5 μg/ml 的重组B7-H3 蛋白（R&D 公司），培养 14 d 后，茜素红S 染色检测成骨细胞矿化，在显微镜下任意选择 5 个视野，进行细胞数统计；收获细胞， real-time PCR检测Cbfa1 的表达。

1.5RNA 提取和real-time PCR检测 Trizol 法提取RNA，测定浓度及纯度。人源 Cbfa1 基因的定量表达检测基于 L40992 序列进行引物设 计（Primer Primie 5.0 软件辅助），随后BLAST 确认引物特异性， 预期产物长度132 bp，用GAPDH 作内参，预期产物长度 197 bp，交由上海生工生物工程有限公司合成。取1 μg 总RNA，按照TOYOBO 逆转录试剂盒说明书进行逆转录，进行 SYBR 掺入法半定量检测Cbfa1 的相对表达量（2-△△CT 法），反应条件: 95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40 个循环，完成PCR 扩增。引物序列如下：Cbfa1 F:5′-CCGCCTC AGTGATTTAGGGC-3′，R：5′-GGGTCTGTAATCTGA CTCTGTCC-3′；GAPDH F：5′-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3′ ，R ：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG

G-3′。

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